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熒光定量ＰＣＲ 實驗步驟：
①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置５分鐘使其完全溶解。
②兩相分離 每１ｍｌ的ＴＲＩＺＯＬ試劑裂解的樣品中加入０．２ｍｌ的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體１５秒后，１５到３０℃孵育２到３分鐘。４℃下１２０００ｒｐｍ離心１５分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。ＲＮＡ全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的ＴＲＩＺＯＬ試劑的６０％。
③ＲＮＡ沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無ＲＮＡ酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的ＲＮＡ，混勻后１５到３０℃孵育１０分鐘后，于４℃下１２０００ｒｐｍ 離心１０分鐘。此時離心前不可見的ＲＮＡ沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④ＲＮＡ清洗 移去上清液，每１ｍｌＴＲＩＺＯＬ試劑裂解的樣品中加入至少１ｍｌ的７５％乙醇（７５％乙醇用ＤＥＰＣＨ２Ｏ配制），清洗ＲＮＡ沉淀。混勻后，４℃下７０００ｒｐｍ離心５分鐘。
⑤ＲＮＡ干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使ＲＮＡ沉淀在室溫空氣中干燥５－１０分鐘。
⑥溶解ＲＮＡ沉淀 溶解ＲＮＡ?xí)r，先加入無ＲＮＡ酶的水４０μｌ用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的ＲＮＡ溶液保存于－８０℃待用。 １）紫外吸收法測定
先用稀釋用的ＴＥ溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量ＲＮＡ溶液用ＴＥ稀釋（１：１００）后，讀取其在分光光度計２６０ｎｍ和２８０ｎｍ處的吸收值，測定ＲＮＡ溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
Ａ２６０下讀值為１表示４０ μｇ ＲＮＡ／ｍｌ。樣品ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍｌ）計算公式為：Ａ２６０ ×稀釋倍數(shù)× ４０ μｇ／ｍｌ。具體計算如下：
ＲＮＡ溶于４０ μｌ ＤＥＰＣ水中，取５ｕｌ，１：１００稀釋至４９５μｌ的ＴＥ中，測得Ａ２６０ ＝ ０．２１
ＲＮＡ 濃度＝ ０．２１ ×１００ ×４０ μｇ／ｍｌ ＝ ８４０ μｇ／ｍｌ 或 ０．８４ μｇ／μｌ
取５ｕｌ用來測量以后，剩余樣品ＲＮＡ為３５ μｌ，剩余ＲＮＡ總量為：
３５ μｌ × ０．８４ μｇ／μｌ ＝ ２９．４ μｇ
②純度檢測
ＲＮＡ溶液的Ａ２６０／Ａ２８０的比值即為ＲＮＡ純度，比值范圍１．８到２．１。
２）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
１ｇ瓊脂糖溶于７２ｍｌ水中，冷卻至６０℃，１０ ｍｌ的１０× ＭＯＰＳ電泳緩沖液和１８ ｍｌ的３７％ 甲醛溶液（１２．３ Ｍ）。
１０×ＭＯＰＳ電泳緩沖液
濃度 成分
０．４Ｍ ＭＯＰＳ，ｐＨ ７．０
０．１Ｍ 乙酸鈉
０．０１Ｍ ＥＤＴＡ
灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入２５ μｌ溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的１×ＭＯＰＳ電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
②準(zhǔn)備ＲＮＡ樣品
取３μｇＲＮＡ，加３倍體積的甲醛上樣染液，加ＥＢ于甲醛上樣染液中至終濃度為１０μｇ／ｍｌ。加熱至７０℃孵育１５分鐘使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預(yù)電泳５ｍｉｎ，隨后將樣品加入上樣孔。５–６Ｖ／ｃｍ電壓下２ｈ，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少２–３ｃｍ。
④紫外透射光下觀察并拍照
２８Ｓ和１８Ｓ核糖體ＲＮＡ的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提ＲＮＡ的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的２倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的ＲＮＡ（ｔＲＮＡ和５Ｓ核糖體ＲＮＡ）組成。在１８Ｓ和２８Ｓ核糖體帶之間可以看到一片彌散的ＥＢ染色物質(zhì)，可能是由ｍＲＮＡ和其它異型ＲＮＡ組成。ＲＮＡ制備過程中如果出現(xiàn)ＤＮＡ污染，將會在２８Ｓ核糖體ＲＮＡ帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，ＲＮＡ的降解表現(xiàn)為核糖體ＲＮＡ帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。 ①反應(yīng)體系 序號 反應(yīng)物 劑量 １ 逆轉(zhuǎn)錄ｂｕｆｆｅｒ ２μｌ ２ 上游引物 ０．２μｌ ３ 下游引物 ０．２μｌ ４ ｄＮＴＰ ０．１μｌ ５ 逆轉(zhuǎn)錄酶ＭＭＬＶ ０．５μｌ ６ ＤＥＰＣ水 ５μｌ ７ ＲＮＡ模版 ２μｌ ８ 總體積 １０μｌ 輕彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。
②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶ＭＭＬＶ 之前先７０℃干浴３分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶０．５μｌ，３７℃水浴６０分鐘。
③取出后立即９５℃干浴３分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為ｃＤＮＡ溶液，保存于－８０℃待用。 管家基因（β－ａｃｔｉｎ）實時定量ＰＣＲ
①β－ａｃｔｉｎ陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為１０１１，反應(yīng)前取３μｌ按１０倍稀釋（加水２７μｌ并充分混勻）為１０１０，依次稀釋至１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４，以備用。
②反應(yīng)體系如下：
標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系 序號 反應(yīng)物 劑量 １ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ 染料 １０μｌ ２ 陽性模板上游引物Ｆ ０．５μｌ ３ 陽性模板下游引物Ｒ ０．５μｌ ４ ｄＮＴＰ ０．５μｌ ５ Ｔａｑ酶 １μｌ ６ 陽性模板ＤＮＡ ５μｌ ７ ｄｄＨ２Ｏ ３２．５μｌ ８ 總體積 ５０μｌ 輕彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。
管家基因反應(yīng)體系： 序號 反應(yīng)物 劑量 １ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ 染料 １０μｌ ２ 內(nèi)參照上游引物Ｆ ０．５μｌ ３ 內(nèi)參照下游引物Ｒ ０．５μｌ ４ ｄＮＴＰ ０．５μｌ ５ Ｔａｑ酶 １μｌ ６ 待測樣品ｃＤＮＡ ５μｌ ７ ｄｄＨ２Ｏ ３２．５μｌ ８ 總體積 ５０μｌ 輕彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。
③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測樣本同時上機，反應(yīng)條件為：９３℃２分鐘，然后９３℃ １分鐘，５５℃ ２分鐘，共４０個循環(huán)。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的ｃＤＮＡ模板進(jìn)行ＰＣＲ反應(yīng)。
反應(yīng)體系： 序號 反應(yīng)物 劑量 １ １０×ＰＣＲ緩沖液 ２．５ ｕｌ ２ ＭｇＣｌ２溶液 １．５ ｕｌ ３ 上游引物Ｆ ０．５ ｕｌ ４ 下游引物Ｒ ０．５ ｕｌ ５ ｄＮＴＰ混合液 ３ ｕｌ ６ Ｔａｑ聚合酶 １ ｕｌ ７ ｃＤＮＡ １ ｕｌ ８ 加水至總體積為 ２５ｕｌ 輕彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。
３５個ＰＣＲ循環(huán)（９４℃１分鐘；５５℃１分鐘；７２℃１分鐘）； ７２℃延伸５分鐘。
②ＰＣＲ產(chǎn)物與 ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ在２％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測ＰＣＲ產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
③將ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行１０倍梯度稀釋： 設(shè)定ＰＣＲ產(chǎn)物濃度為１×１０１０，依次稀釋至１０９、１０８、１０７、１０６、１０５、１０４幾個濃度梯度。 ①所有ｃＤＮＡ樣品分別配置實時定量 ＰＣＲ反應(yīng)體系。
體系配置如下： 序號 反應(yīng)物 劑量 １ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ １ 染料 １０ ｕｌ ２ 上游引物 １ｕｌ ３ 下游引物 １ｕｌ ４ ｄＮＴＰ １ｕｌ ５ Ｔａｑ聚合酶 ２ｕｌ ６ 待測樣品ｃＤＮＡ ５ｕｌ ７ ｄｄＨ２Ｏ ３０ｕｌ ８ 總體積 ５０ ｕｌ 輕彈管底將溶液混合，６０００ｒｐｍ短暫離心。
②將配制好的ＰＣＲ反應(yīng)溶液置于Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ儀上進(jìn)行ＰＣＲ擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：９３℃２分鐘預(yù)變性，然后按９３℃ １分鐘，５５℃１分鐘，７２℃１分鐘，共４０做個循環(huán)，最后７２℃７分鐘延伸。 各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ反應(yīng)。ＰＣＲ產(chǎn)物與 ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ在２％瓊脂糖凝膠電泳，ＧｏｌｄＶｉｅｗ染色，檢測ＰＣＲ產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
（文章來源于互聯(lián)網(wǎng)）
