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１． 定義
數字ＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ） 是一種基于單分子擴增的核酸絕對定量技術，無需依賴標準曲線，通過將反應體系分割成數萬至數百萬個獨立微單元，實現靶基因的“有／無”二元判定，最終通過統計學方法計算目標分子拷貝數。
核心設備：數字ＰＣＲ分析儀（包括微滴生成儀、ＰＣＲ擴增儀、微滴讀取儀三部分）。
２． 技術原理
工作流程
樣本分割：
微滴式（ｄｄＰＣＲ）：油包水微滴（如Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００）。
芯片式（ｃｄＰＣＲ）：微流控芯片分艙（如Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ? ３Ｄ）。
將含有核酸模板的ＰＣＲ反應體系（含熒光探針／染料）分割至大量獨立微單元（微滴或微孔）。
主流分割技術：
ＰＣＲ擴增：
微單元在傳統ＰＣＲ儀中進行熱循環擴增，靶分子獨立擴增產生熒光信號。
熒光檢測：
陽性單元：熒光信號超過閾值（含靶分子）。
陰性單元：無熒光信號（無靶分子）。
使用高通量熒光檢測系統掃描每個微單元的熒光強度。
３． 核心優勢
特性 說明 絕對定量 無需標準曲線，直接輸出目標分子拷貝數／μＬ。 超高靈敏度 可檢測低至０．００１％的罕見突變（如腫瘤ｃｔＤＮＡ）。 強抗干擾能力 對ＰＣＲ抑制劑耐受性顯著高于ｑＰＣＲ。 精密度高 變異系數（ＣＶ）＜５％，適合微小差異檢測（如基因表達微調）。 多重檢測能力 支持多通道熒光（如ＨＥＸ／ＦＡＭ／Ｃｙ５），同時定量多個靶標。 ４． 與傳統技術的對比
參數 數字ＰＣＲ（ｄＰＣＲ） 實時熒光ＰＣＲ（ｑＰＣＲ） 定量方式 絕對定量（直接計數） 相對定量（依賴Ｃｔ值／標準曲線） 靈敏度 可檢測單拷貝差異 通常＞１０倍濃度差異 抗抑制能力 強（抑制劑被分散至微單元） 弱（抑制劑影響整體反應） 成本／通量 單次成本高，中低通量（１－９６樣本／次） 成本低，高通量（３８４孔板） ５． 核心應用場景
（１）精準醫療
腫瘤液體活檢：
超低頻突變檢測（如ＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ）。
微小殘留病灶（ＭＲＤ）監控。
無創產前診斷（ＮＩＰＴ＋）：
染色體微缺失／微重復（如ＤｉＧｅｏｒｇｅ綜合征）。
（２）病原體檢測
病毒超早期感染：ＨＩＶ／ＨＢＶ潛伏期低載量病毒定量。
耐藥株識別：結核分枝桿菌耐藥基因低頻突變。
（３）基因編輯驗證
ＣＲＩＳＰＲ編輯效率精確定量（如脫靶率檢測）。
（４）環境與食品安全
轉基因成分痕量分析（＜０．１％）。
水體／土壤中病原微生物超敏檢測。
６． 技術局限性與挑戰
成本高昂：微滴生成芯片／專用試劑價格較高。
通量有限：單次運行樣本數通常≤９６例（遠低于ｑＰＣＲ的３８４孔板）。
操作復雜度：需嚴格分區防污染（尤其微滴操作）。
數據解讀要求高：需專業軟件分析微滴聚類（如閾值設定）。
７． 儀器關鍵組件
模塊 功能 微滴生成儀 將樣本分割為均一微滴（油包水體系）或加載至微孔芯片。 ＰＣＲ擴增儀 提供標準熱循環條件（與傳統ＰＣＲ儀兼容）。 微滴讀取儀 高通量熒光掃描儀，識別每個微滴的熒光信號（多通道濾光片系統）。 分析軟件 自動識別陽／陰性微滴，計算濃度并輸出結果（如ＱｕａｎｔａＳｏｆｔ?、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ?）。 ８． 發展趨勢
集成自動化：一體化設備整合微滴生成、擴增與檢測（如Ｓｔｉｌｌａ Ｎａｉｃａ系統）。
納升級微滴：提升分割密度（百萬級／樣本），進一步提高靈敏度。
多重檢測升級：６色以上熒光通道，實現單次檢測＞１０靶標。
成本降低：微流控芯片批量化生產推動單次檢測費用下降。
臨床認證加速：ＦＤＡ／ＣＥ認證試劑盒增多（如乳腺癌ＰＩＫ３ＣＡ突變檢測）。
９． 代表機型
品牌 型號 技術路線 通量 Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＱＸ２００? Ａｕｔｏ ＤＧ 微滴式（ｄｄＰＣＲ） ８樣本／批次 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ? Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｑ 芯片微孔（ｃｄＰＣＲ） ２４樣本／芯片 Ｓｔｉｌｌａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎａｉｃａ? Ｓａｐｐｈｉｒｅ 微滴式（Ｃｒｙｓｔａｌ?） ６樣本／芯片 Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｃｕｉｔｙ? 納米板式 ２４／９６樣本 總結
數字ＰＣＲ分析儀憑借單分子絕對定量能力，在超低豐度靶標檢測領域具有不可替代性，尤其推動液體活檢、痕量病原體診斷等精準醫學發展。盡管存在成本與通量限制，但隨著微流控技術進步和臨床需求增長，其正在從科研向臨床診斷快速滲透，成為分子診斷領域的“金標準”級工具。
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